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【巴爺爺?shù)牟┛汀咳绾巫屇牡鞍踪|(zhì)配方穩(wěn)定更持久？

步琦 2022-02-17 | 閱讀：1567

不管您是要建立一座沙堡、一個(gè)核反應(yīng)堆還是一段新的戀情，亦或是一種新的蛋白質(zhì)配方，穩(wěn)定持久都是非常重要的指標(biāo)。因此，我將兌現(xiàn)之前的承諾完成蛋白質(zhì)配方系列文章；在這個(gè)系列中，我會(huì)深入研究噴霧干燥和冷凍干燥方法在蛋白質(zhì)和多肽中的應(yīng)用。本篇文章可以學(xué)習(xí)到更多關(guān)于如何使用這些技術(shù)方法來(lái)實(shí)現(xiàn)如何確定穩(wěn)定的蛋白質(zhì)配方。

最近，我看了一部關(guān)于堅(jiān)固人造建筑的紀(jì)錄片，例如胡佛水壩（Hoover Dam）和梅厄塔（Torre Mayor）。顯然地，梅厄塔不僅在2003年的7.6級(jí)地震中幸存下來(lái)，當(dāng)時(shí)在里面的工作人員甚至沒(méi)有注意到顫動(dòng)。

工程師們喜愛(ài)穩(wěn)定，科學(xué)家們也是一樣。每當(dāng)我們進(jìn)行蛋白制劑干燥時(shí)，就像那些工程師和建筑師一樣，我們最關(guān)心的是如何實(shí)現(xiàn)產(chǎn)品的長(zhǎng)久穩(wěn)定性。通常配制的小分子制劑中水分含量足夠低，所以可以不添加賦形劑就能讓配方在較長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)保持穩(wěn)定。

另一方面，蛋白質(zhì)要比多肽更加不穩(wěn)定；它的穩(wěn)定性與其構(gòu)象結(jié)構(gòu)和配方含水量都密切相關(guān)。蛋白制劑需要保持一定水分含量來(lái)避免變性，因此需要優(yōu)化蛋白質(zhì)配方和控制干燥工藝避免出現(xiàn)穩(wěn)定性問(wèn)題。在某些案例中，干燥過(guò)程中的蛋白質(zhì)甚至?xí)兊煤懿环€(wěn)定，但如果沒(méi)有發(fā)生聚合等不可逆反應(yīng)，蛋白質(zhì)仍可以完全再折疊，并在重構(gòu)后表現(xiàn)出合適的藥物穩(wěn)定性。

一個(gè)精心設(shè)計(jì)的配方要考慮到分子特異性、過(guò)程中干燥應(yīng)力、蛋白質(zhì)生產(chǎn)和純化的方法以及分子的降解途徑。當(dāng)然，接下來(lái)是確定蛋白質(zhì)配方的技術(shù)參數(shù)：

通過(guò)噴霧干燥進(jìn)行配制蛋白質(zhì)制劑

噴干蛋白質(zhì)樣品高度依賴(lài)樣品性質(zhì)、儀器設(shè)計(jì)和過(guò)程參數(shù)設(shè)定。

影響最終產(chǎn)品質(zhì)量的因素有：

* 形態(tài)

* 殘留水分

* 顆粒大小

為減少蛋白質(zhì)配方中蛋白質(zhì)或多肽的熱降解，應(yīng)該多關(guān)注溫度和滯留時(shí)間。各參數(shù)中出口溫度是防止熱降解的關(guān)鍵所在。

當(dāng)出口溫度低于蛋白質(zhì)的降解溫度時(shí)，物質(zhì)所經(jīng)受的熱降解就會(huì)降低。但是出口溫度過(guò)低會(huì)使殘留水分增加，從而導(dǎo)致貨架期縮短。所以重要的是找到理想的出口溫度，既可以讓樣品變?yōu)楦稍锓勰植粫?huì)引起蛋白質(zhì)配方的降解。

通常，生物制藥的蛋白質(zhì)噴霧干燥其出口溫度要低于100 ℃，同時(shí)進(jìn)料速度都很低。

滯留時(shí)間對(duì)于最小化熱敏性樣品的熱降解非常重要。表面水分含量高的細(xì)小顆粒噴霧更容易進(jìn)行蒸發(fā)，所以他們的滯留時(shí)間很短；低水分含量的細(xì)小至半粗糙的噴霧，需要中等滯留時(shí)間；而殘留水分更低的粗糙噴霧，則需要最長(zhǎng)滯留時(shí)間。

根據(jù)研究報(bào)道，10 μm大小的純水液滴蒸發(fā)需要0.03 s，100 μm的液滴需要3 s。

在蛋白質(zhì)配方應(yīng)用中，通常實(shí)驗(yàn)室級(jí)噴霧干燥儀的滯留時(shí)間在0.2到0.35秒之間。滯留時(shí)間根據(jù)干燥室體積和干燥氣體流量決定。由于干燥室體積是恒定的，只有氣體流量可以調(diào)節(jié)。大多數(shù)噴霧干燥儀都以最大干燥氣體流量運(yùn)行，以保證最大限度的噴干能力。

通過(guò)冷凍干燥進(jìn)行配制蛋白質(zhì)制劑

冷凍干燥過(guò)程中最關(guān)鍵的一步是預(yù)凍，因?yàn)樗鼪Q定了干燥產(chǎn)品的微觀結(jié)構(gòu)。您需要在足夠低的溫度下進(jìn)行冷凍產(chǎn)品，以使產(chǎn)品完全固化。大多數(shù)液體樣品，包括蛋白質(zhì)配方制劑，都是通過(guò)形成冰晶來(lái)完成冷凍。冰晶的大小和形狀取決于冷卻速度，并決定了顆粒的凍干能力。

快速冷凍會(huì)形成小冰晶，而緩慢冷凍則會(huì)產(chǎn)生大尺寸冰晶。在凍干過(guò)程中，小冰晶比大冰晶更難以從產(chǎn)品中除去。雖然如此，蛋白質(zhì)制劑的預(yù)凍溫度是由其特性和配方組成決定的。

配方制劑通常有兩種不同的預(yù)凍方式。共晶混合物中包含物質(zhì)的結(jié)冰點(diǎn)要低于周?chē)乃．?dāng)共晶混合物進(jìn)行冷凍時(shí)，水因?yàn)榻Y(jié)冰會(huì)先從這些物質(zhì)中分離出來(lái)的。從表面來(lái)看，蛋白質(zhì)配方制劑已經(jīng)冷凍，但其中的溶質(zhì)物質(zhì)仍然是液體狀態(tài)。它們會(huì)形成濃度集中區(qū)域，最終在低于水的冰點(diǎn)溫度下冷凍結(jié)冰。

當(dāng)混合物中所有組分都被完全凍結(jié)時(shí)的溫度稱(chēng)為共晶溫度，也是蛋白質(zhì)配方制劑的臨界溫度，是其在凍干過(guò)程中所能承受的最大溫度。

由于未凍結(jié)的組分會(huì)在真空下膨脹，對(duì)未完全凍結(jié)的共晶混合物進(jìn)行抽真空可能破壞樣品。

另一類(lèi)混合物是無(wú)定形樣品，在凍結(jié)時(shí)會(huì)形成玻璃態(tài)。隨著溫度降低，蛋白質(zhì)配方變得更加粘稠，最終在玻璃化轉(zhuǎn)化點(diǎn)凍結(jié)成玻璃狀固體。對(duì)于非晶體樣品，穩(wěn)定性方面的溫度臨界點(diǎn)稱(chēng)為塌陷溫度，塌陷溫度一般會(huì)略低于玻璃轉(zhuǎn)化溫度。通常，無(wú)定形樣品的冷凍干燥非常困難。

蛋白質(zhì)是具有相對(duì)較高的玻璃轉(zhuǎn)化溫度的分子，因此很容易進(jìn)行冷凍和干燥。冷凍后，嵌入蛋白質(zhì)的最終結(jié)構(gòu)就形成了。如果結(jié)構(gòu)不正確，蛋白質(zhì)就會(huì)鎖定在錯(cuò)誤的構(gòu)象中可能導(dǎo)致失去活性。因此，冷凍方法(慢vs快)及其對(duì)蛋白質(zhì)完整性的影響非常重要。

通常對(duì)于初級(jí)干燥來(lái)說(shuō)，您可以通過(guò)玻璃轉(zhuǎn)化溫度來(lái)確定擱板溫度和干燥室壓力，用以設(shè)定凍干循環(huán)參數(shù)。凍干處理的階段時(shí)間可以使用工具確定，例如終點(diǎn)判定(溫度和壓力)或科學(xué)的知識(shí)經(jīng)驗(yàn)。

初級(jí)干燥是利用分子熱特性來(lái)進(jìn)行的，而次級(jí)干燥循環(huán)則是利用分子熱穩(wěn)定性來(lái)進(jìn)行。

擱板溫度和凍干時(shí)間會(huì)影響產(chǎn)品活性。次級(jí)干燥也決定樣品的殘留水分等級(jí)，從而決定了產(chǎn)品的穩(wěn)定性和保質(zhì)期限。在產(chǎn)品保質(zhì)期限內(nèi)殘留的水分會(huì)促使降解反應(yīng)發(fā)生，所以應(yīng)保持在一個(gè)較低的水平，通常殘留含水量低于 3 %。

為您的蛋白質(zhì)配方制劑提出一些建議：

* 蛋白質(zhì)和多肽需要儲(chǔ)存在 -80 ℃ 環(huán)境中，不建議在 -20 ℃。在儲(chǔ)存之前，必須要過(guò)濾純化的蛋白質(zhì)成分。使用干冰/乙醇混合物來(lái)快速冷凍比在 -20 ℃ 環(huán)境下慢凍要好。為了增加儲(chǔ)存、凍融周期過(guò)程中的穩(wěn)定性，可以考慮在混合物中加入蔗糖或甘油。謹(jǐn)慎選擇蛋白質(zhì)制劑的溶劑，可以考慮使用保護(hù)劑，如海藻糖，用以穩(wěn)定分子結(jié)構(gòu)并幫助保持產(chǎn)品功能活性。

* 如果可以的話(huà)，請(qǐng)測(cè)量出蛋白質(zhì)的降解溫度，或者也可嘗試測(cè)定蛋白質(zhì)配方制劑（蛋白質(zhì)+輔料）的玻璃轉(zhuǎn)化溫度。

* 在蛋白質(zhì)配方中添加糖和糖類(lèi)添加劑，以保護(hù)噴霧干燥和冷凍干燥的蛋白質(zhì)免受脫水和熱應(yīng)激效應(yīng)的影響。

* 考慮蛋白質(zhì)配方設(shè)計(jì)是否選擇了合適的干燥方法。對(duì)于不適合進(jìn)行冷凍干燥的蛋白質(zhì)配方，則很難設(shè)計(jì)出合適的凍干循環(huán)參數(shù)。例如，磷酸鹽緩沖鹽溶液的蛋白質(zhì)樣品極難進(jìn)行冷凍干燥處理。

* 為每個(gè)樣品開(kāi)發(fā)和優(yōu)化冷凍干燥方法：一個(gè)方法并不適合所有產(chǎn)品。

冷凍干燥前的預(yù)凍方法會(huì)明顯影響冰晶結(jié)構(gòu)的形成，進(jìn)而影響初級(jí)干燥和最終產(chǎn)品中水蒸氣的流動(dòng)。嘗試控制溶液的預(yù)凍凍結(jié)方式，以縮短凍干時(shí)間，獲得更穩(wěn)定的蛋白質(zhì)配方制劑。

希望您可以從這篇文章中了解到相關(guān)的知識(shí)，讓我們看看您的蛋白質(zhì)制劑是否和胡佛水壩一樣堅(jiān)固持久吧！

下次見(jiàn)！