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簡介

實驗設(shè)備

試劑和材料

實驗過程

運行條件 Sepmatix 8x SFC：

• 流動相：A =二氧化碳；B=甲醇

• 色譜柱尺寸：250 x 4.6 mm

• 流速：3ml /min（每根色譜柱）

• 流動相條件：0-0.5 min: 5% B

• 0.5-8.0 min：5-50% B

• 8.0-9.4 min：50% B

• 9.4-9.5 min：50-5% B

• 9.5-10 min：5% B

• 檢測：200nm - 600nm 紫外掃描

篩選運行是完全自動開始的。使用流量控制單元將流量設(shè)置為每通道3ml /min，并平衡色譜柱。自動進樣（V = 5 μL），開始平行篩選（運行時間= 10 min）。背壓調(diào)節(jié)器設(shè)置為150 bar，柱箱加熱至32°C。添加劑需要提前被添加到改性劑中。

SFC-50 運行條件：

• 流動相：A =二氧化碳；B=甲醇

• 柱尺寸：250 × 10mm

• 流動相條件：等度運行

• 檢測：紫外

SFC柱在規(guī)定的流速下條件平衡3分鐘。使用定量環(huán)自動進樣，并開始運行。背壓調(diào)節(jié)器設(shè)置為150 bar，柱箱加熱至40°C。添加劑需要提前被添加到改性劑中。

實驗結(jié)果

5.1 對乙酰氨基酚

對乙酰氨基酚（Acetaminophen，AA），也被稱為撲熱息痛，是一種鎮(zhèn)痛、解熱和非手性藥物。它屬于非阿片類鎮(zhèn)痛藥。化學(xué)上可以通過對氨基酚（AP）與乙酸酐反應(yīng)合成，其中N-乙酰化發(fā)生（見圖1）。為了確定對乙酰氨基酚合成產(chǎn)物純化的理想選擇性，第一步進行了色譜柱篩選（見圖1）。

共洗脫發(fā)生在二醇相和 2-EP 相。硅膠，CBD，氰基和氨基相沒有表現(xiàn)出理想的選擇性，因為沒有基線分離可以在這里實現(xiàn)。HILIC和PEI相表現(xiàn)出良好的選擇性和分辨率，因為分辨率總是高于1.5（見表1）。1.5的分辨率意味著兩個峰可以很好地分離。表1 也顯示了洗脫順序。氰基相呈現(xiàn)出相反的洗脫趨勢，對氨基酚先被洗脫，對乙酰氨基酚后被洗脫。篩選結(jié)果表明，該反應(yīng)并非 100% 完成，產(chǎn)物中仍存在大量對氨基酚。

表1. SFC 條件下不同篩選柱的分辨率值和洗脫順序

選擇 PEI 色譜柱進行制備純化，因為它具有最高的分辨率（見圖2）。根據(jù)篩選得到的色譜圖，利用梯度法可以確定 AA 和 AP 洗脫時流動相中甲醇的近似含量。該改性劑含量可作為等度制備方法的指導(dǎo)值。AA 和 AP 洗脫液中改性劑含量在 35-40% 之間。圖2（上）為改性劑含量為 40% 時，在制備 PEI 柱上對AA的純化。AA 和 AP 可以很好地分離。在相同條件下，可采用疊層進樣法對 AA 進行自動化純化（見下圖2）。因為只有AA是相關(guān)的，所以不收集 AP。

5.2 利多卡因

利多卡因(L)，化學(xué)式為2-二乙胺- N -（2,6-二甲基苯基）乙酰胺，是一種用作局部麻醉劑和抗心律失常藥物的藥物。它起到鈉通道阻滯劑的作用。利多卡因可以兩步合成（見圖3）。在第一步中，2,6 二甲醚(X)的氨基被酰化。在第二步中，中間產(chǎn)物（IP）通過與二甲胺的親核取代轉(zhuǎn)化為利多卡因。因此，需要兩個純化步驟。色譜柱篩選的結(jié)果如 圖2 所示。在改性劑甲醇中始終加入 20mm 氨水作為堿性添加劑。

原則上，任何篩選的相都可以用于 IP 的純化，因為總是可以實現(xiàn)基線分離。氨基相在改性劑含量相對較低的情況下具有最高的分辨率。X 和 IP 的洗脫順序在每一相中都是恒定的。對于L的純化，氰基和 CBD 相沒有達到基線分離（見表2）。同樣，氨基相顯示出最高的分辨率。硅膠相是唯一表現(xiàn)出反洗脫趨勢的相。否則，L 總是先洗脫。篩選結(jié)果表明，不可能每一步都達到 100% 的產(chǎn)率。這是不尋常的合成 IP，因為酸性氯化物是高活性的。據(jù)推測，在合成過程中，化學(xué)計量學(xué)出現(xiàn)了錯誤，導(dǎo)致 X 的添加過量。

表2. SFC 條件下不同篩選柱的分辨率值和洗脫順序

選擇氨基色譜柱進行制備性純化，因為它具有最高的分辨率（見圖4）。篩選結(jié)果表明，X 和 IP 的洗脫量約為 10-19%，L 和 IP 的洗脫量約為 11-19%。圖4a 為改性劑 16% 時純化 IP 的制備性單次進樣，圖4b 為改性劑 20% 時純化L的制備性單次進樣。在相同的條件下，可以進行疊層進樣，分別對 IP 和 L 進行自動純化（見 圖4c 和 圖4d）。因為只有 IP 或 L 是相關(guān)的，所以不收集反應(yīng)物。

5.3 乙酰水楊酸

阿司匹林，化學(xué)成分為乙酰水楊酸（ASA），是一種眾所周知的鎮(zhèn)痛和抗炎藥。它屬于非甾體類抗風(fēng)濕藥。它可以通過水楊酸（SA）與乙酸酐的化學(xué)反應(yīng)合成，并發(fā)生酯化反應(yīng)（見圖5）。為了確定乙酰水楊酸純化的理想選擇性，第一步進行了色譜柱篩選（見圖5）。

由于 SA 在固定相中的高保留率，在梯度中添加 50% 改性劑 5 分鐘的等度分離以促進 SA 的洗脫。HILIC 相只有噪聲，ASA 和 SA 沒有洗脫。在 PEI 相中，實驗條件下只有 ASA 洗脫。除氰基相外，其余相均表現(xiàn)為 ASA 和 SA 的分離。2-EP 階段顯示了潛在運行時間和分辨率方面的最佳結(jié)果（參見表3）。篩選色譜圖顯示 ASA 合成沒有達到 100% 產(chǎn)率。

表3. SFC 條件下不同篩選柱的分辨率值和洗脫順序

選擇 2-EP 相進行制備純化。篩選結(jié)果表明，改性劑含量約為 26-40% 時，ASA 和 SA 可被洗脫。圖6（上）為改性劑含量為 40% 時，ASA 在 2-EP 制備柱上的純化結(jié)果。在改性劑中加入 0.5% 甲酸，改善 SA 的峰形。SA 在沒有甲酸的情況下顯示出很強的尾砂。隨著甲酸的加入，SA 的尾砂峰值降低。在相同條件下，可以采用疊層進樣法對 ASA 進行自動化純化（見下圖6）。因為只有 ASA 是相關(guān)的，所以不收集 SA 和其他雜質(zhì)。

5.4 苯佐卡因

苯佐卡因（BC），化學(xué)名稱為 4-氨基苯甲酸乙酯，屬于局部麻醉劑。以對氨基苯甲酸（PABA）為原料，羧基與乙醇經(jīng)酸催化酯化反應(yīng)可合成對氨基苯甲酸（PABA）。硫酸被用作催化劑。進行柱篩選以確定苯佐卡因合成產(chǎn)物純化的理想選擇性（見圖7）。

由于PABA在固定相中的高保留率，在梯度中增加了一個在50%改性劑下5分鐘的等度步驟。由于酸性，用洗滌步驟除去了硫酸。各固定相的色譜圖表明，各固定相均能分離苯佐卡因。在洗脫速度和分辨率上存在較大差異（見表4）。苯佐卡因總是在PABA之前被洗脫。HILIC相和氨基相的分辨率最高，而PABA相的保留率很高，即使改性劑含量達到50%。色譜圖也表明酯化反應(yīng)尚未完成。

表4. SFC 條件下不同篩選柱的分辨率值和洗脫順序

選擇二醇相進行制備純化。HILIC 相和氨基相要求改性劑含量高，運行時間長。二醇相顯示樣品的快速洗脫，具有足夠高的分辨率。篩選結(jié)果表明，改性劑含量約為 30-40% 時，BC 和 PABA 均可洗脫。圖8（上）顯示了在改性劑含量為 28% 的制備二醇柱上純化 BC。在相同條件下，可以采用疊層進樣法對 BC 進行自動化純化（見下圖8）。因為只有 BC 是相關(guān)的，所以不收集 PABA。

5.5 普魯卡因

普魯卡因（PC），化學(xué)式為4-氨基苯甲酸2-（N，N-二乙胺）乙酯，是一種藥物，用作局部麻醉劑。它阻斷了依賴電壓的鈉離子通道，從而導(dǎo)致對疼痛的敏感性降低。普魯卡因是由4-氨基苯甲酸乙酯（ABE）化學(xué)堿催化合成的。這涉及到與2-二乙胺乙醇的酯交換反應(yīng)。該堿為乙醇酸鈉，可由單質(zhì)鈉與乙醇反應(yīng)生成。進行柱篩選以確定純化普魯卡因合成產(chǎn)物的理想選擇性（見圖9）。

由于 PC 在固定相中的高保留率，在梯度中增加了一個在 50% 改性劑下 5 分鐘的等度步驟。原則上，每個固定相對普魯卡因的純化都有合適的選擇性（見表5）。普魯卡因在硅膠、PEI和氰基相中具有較高的保留率。由于普魯卡因的基本性質(zhì)，在篩選條件下，相應(yīng)峰的峰形較差。二醇相為強前向，不對稱度為0.58；硅膠相為強尾向，不對稱度為 2.73。ABE 后每個固定相的 PC 洗脫。

表5. SFC 條件下不同篩選柱的分辨率值和洗脫順序。

選擇 2-EP 相進行制備純化。硅膠相需要高含量的改性劑，這導(dǎo)致運行時間長，峰形差。2-EP 相顯示樣品的快速洗脫，具有足夠高的分辨率。甲醇改性劑中加入 5% 去離子水和 20mm 氨水作為添加劑。篩選結(jié)果表明，改性劑含量為 24 ~ 32% 時， BC 和 PABA 的洗脫效果較好。圖10（上）為改性劑含量為 25% 時，PC 在 2-EP 制備柱上的純化結(jié)果。在相同條件下，可采用疊層進樣法對 PC 進行自動化純化（見下圖10）。添加劑的加入顯著改善了 PC 的峰形。

實驗結(jié)論